霉菌廣泛分布于土壤、水、空氣等自然環(huán)境中。由于霉菌孢子可以較長(zhǎng)時(shí)間存活于空氣中，并通過(guò)空氣傳播給其他物質(zhì)，因此無(wú)所不在，防不勝防，給人類的生活和健康帶來(lái)很多危害。霉菌及霉菌毒素污染所造成的損失早已引起人們的高度重視，特別是食品衛(wèi)生領(lǐng)域，近年來(lái)世界各國(guó)紛紛制訂多種食品中毒菌及霉菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)加強(qiáng)對(duì)霉菌檢測(cè)技術(shù)的研究，并不斷提出新的見(jiàn)解，完善該項(xiàng)技術(shù)。

早在我國(guó)1997頒布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB16740-1997中，就已經(jīng)將所有的保健食品都增加了霉菌指標(biāo)。各級(jí)食品衛(wèi)生檢測(cè)機(jī)構(gòu)也都全面開(kāi)展霉菌的檢測(cè)工作。由于霉菌檢測(cè)技術(shù)起步較晚，加上其生理和形態(tài)的多樣化和復(fù)雜性，至今仍有不少基本的問(wèn)題得不到很好的解決。近年來(lái)，這方面的研究進(jìn)展很快，國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者提出了許多改進(jìn)措施，為了更好地解決霉菌檢測(cè)過(guò)程中遇見(jiàn)的各種問(wèn)題，本文根據(jù)作者的實(shí)驗(yàn)觀察，并結(jié)合國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究的最新進(jìn)展，對(duì)霉菌檢測(cè)過(guò)程中幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題試作全面的探討。

一、培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基的選擇應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料和檢驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定。目前國(guó)標(biāo)方法中使用的培養(yǎng)基有：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、孟加拉培養(yǎng)基(RBC)、高鹽察氏培養(yǎng)基(CAO)，其中PDA和RBC適合于一般的霉菌和酵母菌生長(zhǎng)，而CAO則適合于高滲性霉菌生長(zhǎng)，酵母菌幾乎不長(zhǎng)。

在日常檢測(cè)中我們發(fā)現(xiàn)，有些常見(jiàn)的耐高滲性霉菌，如局限曲霉、謝瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生長(zhǎng)非常緩慢或不長(zhǎng)，而這些菌在高滲培養(yǎng)基如M40Y、DG18(M40Y瓊脂配方：蔗糖400g，麥芽提取汁20g，酵母提取汁5g，瓊脂20g，氯霉素50mg，蒸餾水1000ml；DG18瓊脂配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，氯霉素0.1g，0.2%二氯硝基苯胺1.0mL，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，PH6.5)上則正常生長(zhǎng)。孢子、形態(tài)特征發(fā)育良好，而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生長(zhǎng)，因此，若能同時(shí)采用PDA和M40Y(或DG18)分離培養(yǎng)各類樣品中的霉菌，將能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特別是對(duì)干燥食品、高糖食品、淹漬食品等，更有必要同時(shí)采用M40Y或DG18。

由于霉菌中很多種類不會(huì)產(chǎn)生有毒的霉菌毒素，危害較小，而有的菌株即使污染數(shù)量不多，但其產(chǎn)生的霉菌毒素卻危害較大，因此僅作霉菌計(jì)數(shù)并不能全面反映其危害程度，重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判斷被污染食品的安全程度。

為此，國(guó)外有些研究者設(shè)計(jì)出各類選擇性培養(yǎng)基，可以識(shí)別產(chǎn)毒的霉菌。如AFPA培養(yǎng)基(配方：酵母提取汁20g,蛋白胨10g,檸檬酸鐵銨0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,瓊脂15g,蒸餾水1000mL,PH5.6)用于分離黃曲霉毒素產(chǎn)生菌高污染率的食品。產(chǎn)黃曲霉毒素的菌株黃曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培養(yǎng)2~3天就形成背面有亮橙黃色的特征性菌落，非常容易識(shí)別。有人利用該培養(yǎng)基分離黃曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了滿意的結(jié)果。因此,針對(duì)不同樣品,有目的地設(shè)計(jì)出相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基,以篩選污染菌中的危險(xiǎn)菌群,將是一個(gè)值得探索的方向。

二、接種方式

接種方式主要有傾注法和涂布法兩種。目前國(guó)際方法中采用傾注法，但近來(lái)國(guó)際上有不少學(xué)者認(rèn)為霉菌計(jì)數(shù)采用涂布法更合適。

Beuchat和Matsuda等人分別對(duì)這兩種方法作了大量比較試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，對(duì)霉菌計(jì)數(shù)來(lái)說(shuō)，涂抹法有以下幾方面優(yōu)越于傾注法：①培養(yǎng)出的霉菌菌落數(shù)較多；②培養(yǎng)所需的時(shí)間較短；③霉菌孢子、菌落形態(tài)特征發(fā)育完全，便于鑒定。這是因?yàn)榻^大多數(shù)霉菌是好氧的，在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)快，發(fā)育好，而混在培養(yǎng)基中發(fā)育就受影響，而且在培養(yǎng)基傾注時(shí)霉菌孢子易受熱損傷。我們?cè)谧约旱膶?shí)驗(yàn)室也做了類似的比較試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)30種常見(jiàn)霉菌的試驗(yàn)證實(shí)了上述的結(jié)論。因此，我們認(rèn)為，霉菌計(jì)數(shù)采用涂布法既準(zhǔn)確又省時(shí)，值得推廣。

三、培養(yǎng)溫度

經(jīng)對(duì)多種常見(jiàn)霉菌的最適生長(zhǎng)溫度作了調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大部分菌種的最適溫度為25~30℃。但一些產(chǎn)曲霉毒素的菌株或動(dòng)物致病菌則需要更高的溫度，如黃曲霉35℃、構(gòu)巢曲霉33℃、煙曲霉37℃、小孢子菌35℃。因此，培養(yǎng)溫度也應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)目的而定，一般情況下都采用25~28℃培養(yǎng)，若有特殊培養(yǎng)目的，則應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度。

四、培養(yǎng)時(shí)間

我們對(duì)30種常見(jiàn)霉菌的生長(zhǎng)速度作了調(diào)查，正常培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)3~4天的菌落數(shù)與5~7天的基本相同，但菌種的特征不明顯，因此，如果只要作霉菌計(jì)數(shù)，培養(yǎng)3~4天已基本達(dá)到目的，但如果還要進(jìn)一步分類鑒定，則需要培養(yǎng)更長(zhǎng)的時(shí)間(7~14天)。必須特別注意的是，有幾類生長(zhǎng)特別快、菌絲很多的菌，則必需在48小時(shí)以內(nèi)計(jì)數(shù)，否則菌絲就會(huì)覆蓋整個(gè)平皿，無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。這類菌主要有：毛霉、根霉、犁頭霉、共頭霉、木霉等濕度較大的樣品，這類菌污染較多，檢測(cè)這類樣品，應(yīng)提早觀察記錄。

五、最適計(jì)數(shù)范圍

霉菌菌落由孢子和菌絲組成，相當(dāng)擴(kuò)散，在直徑9cm的平皿里，菌落數(shù)稍多就相互交叉重疊，影響計(jì)數(shù)，但數(shù)量太少又會(huì)產(chǎn)生較大的誤差，因此選擇適當(dāng)?shù)南♂尪扔?jì)數(shù)是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

我們對(duì)這方面作了一些觀察研究，首先是將實(shí)驗(yàn)菌株的斜面培養(yǎng)物制成含有約10⁶個(gè)/ml的孢子懸液，并用血球計(jì)數(shù)器在顯微鏡下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，然后將孢子懸液作10^-1~10^-6倍稀釋，吸取不同稀釋度的稀釋液接種于PDA，25℃培養(yǎng)5天后計(jì)數(shù)。30種常見(jiàn)霉菌的兩種不同計(jì)數(shù)方法所得結(jié)果比較顯示，大部分菌株每平板含有10~50個(gè)菌落的稀釋度時(shí)的計(jì)數(shù)與顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果最接近；有近一半的菌株，每個(gè)平板含50~100個(gè)菌落已較難計(jì)數(shù)，而大部分菌株，超過(guò)100個(gè)/平皿或小于10個(gè)/平皿的計(jì)數(shù)結(jié)果就與顯微計(jì)數(shù)結(jié)果存在較大差別，因此，應(yīng)盡量選擇10~50個(gè)/平皿的稀釋度進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)。

而對(duì)上述提及的菌絲很豐富、菌落特別擴(kuò)散的毛霉、根霉、犁頭霉等菌株，則應(yīng)在更少的范圍內(nèi)計(jì)數(shù)(30個(gè)/平皿以內(nèi))。為控制霉菌的生長(zhǎng)速度和菌落的生長(zhǎng)范圍，可在培養(yǎng)基中添加少量抗生素，如氯霉素(50~100mg/L)，金霉素(20~100mg/L)，慶大霉素(50mg/L)，土霉素(100mg/L)等。

六、霉菌檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)特別注意的事項(xiàng)

1、由于霉菌檢測(cè)所需的時(shí)間較長(zhǎng)，中間又需要多次觀察，因此實(shí)驗(yàn)前一定要作好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，明確觀察記錄的時(shí)間。

2、霉菌孢子通過(guò)空氣傳播，所以實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)室平靜，減少空氣流通；操作時(shí)手腳要快，動(dòng)作要輕，特別是培養(yǎng)過(guò)程中，如果觀察時(shí)動(dòng)作過(guò)大，早期生長(zhǎng)出的霉菌孢子就會(huì)在培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散，形成新的菌落，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。

3、實(shí)驗(yàn)前應(yīng)認(rèn)真做好全面的消毒工作，包括操作人員手指、實(shí)驗(yàn)室空間、實(shí)驗(yàn)臺(tái)等，實(shí)驗(yàn)后應(yīng)第一時(shí)間將有霉菌的培養(yǎng)物高壓滅菌，防止進(jìn)一步擴(kuò)散。

4、對(duì)使用的菌株的生理、生態(tài)、形態(tài)、毒理、致病性必需有充分的了解，并作好相應(yīng)的防擴(kuò)措施,防止污染其它物品。